D’où vient la méthode CRISPR/Cas9
La technique CRISPR/Cas9 repose sur un mécanisme de défense naturel présent chez les bactéries. Les bactéries stockent dans leur génome de courtes séquences d’ADN des virus qui les infectent. Ces segments d’ADN répétitifs sont appelés CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). En cas de nouvelle infection par le même virus, la bactérie le reconnaît et peut se défendre contre lui.
Comment fonctionne CRISPR/Cas9
Les bactéries transcrivent régulièrement CRISPR, ces courtes séquences d’ADN viral, en micro-séquences d’ARN. Cela crée des copies de fragments du génome des virus. Lorsque ces copies d’ARN rencontrent le virus original dans la cellule, le virus est reconnu et l’ARN se lie à la séquence virale homologue identique. Cela permet à la protéine Cas9 de couper le génome viral et de le rendre ainsi inoffensif. En bref, Cas9 est un ciseau ou une paire de ciseaux moléculaires qui coupe l’ADN à l’endroit où une copie ARN de CRISPR se lie. Le mécanisme exact n’a été compris qu’en 2012 et rendu utilisable pour la biotechnologie.
Les scientifiques se sont particulièrement intéressés à la capacité des ciseaux moléculaires Cas9 à couper l’ADN à un endroit très précis, déterminé par la correspondance avec l’ARN. Dans l’application biotechnologique, un ARN guide (gRNA) identique à la séquence d’un gène recherché est produit synthétiquement et introduit dans une cellule avec la protéine Cas9. Cet ARN guide reconnaît la séquence d’ADN dans le génome de la cellule végétale par homologie et se lie à cette séquence. La protéine Cas9 reconnaît cette liaison ARN-ADN et coupe l’ADN. Cette interface dans l’ADN est ensuite utilisée pour générer des mutations, insérer ou supprimer des séquences génétiques de différentes longueurs. Cela se fait en partie grâce aux mécanismes de réparation naturels des cellules.
Le mécanisme exact n’a été découvert qu’en 2012 et rendu utilisable pour la biotechnologie. Pour ce faire, le fonctionnement initial de ce système de défense bactérien est imité afin de couper l’ADN à un endroit précis. À cette fin, un ARN guide (gRNA), identique à la séquence génétique souhaitée, est synthétisé et introduit dans une cellule avec la protéine Cas. Pour ce faire, on utilise généralement les méthodes conventionnelles de génie génétique, c’est-à-dire que la construction génétique est introduite dans la cellule à l’aide d’un canon à gènes ou d’un vecteur.
L’ARN guide se fixe ensuite à la séquence d’ADN recherchée et la protéine Cas9 coupe les deux brins d’ADN (rupture double brin). Cette coupure est ensuite réparée par les mécanismes de réparation cellulaires.
Cette possibilité de cibler et de couper efficacement des séquences d’ADN avec CRISPR/Cas9 est décisive pour la biotechnologie. Ces coupes sont utilisées pour créer des mutations, insérer ou supprimer des séquences génétiques plus ou moins longues. Le système CRISPR/Cas a révolutionné la biotechnologie, car il est beaucoup plus simple et rapide à développer que les techniques apparentées. Et il est en outre beaucoup moins coûteux.
Différences entre les méthodes conventionnelles de génie génétique et CRISPR/Cas9
Les différences entre les modifications génomiques avec CRISPR/Cas9 et le génie génétique conventionnel ne sont pas les mêmes pour tous les organismes. D’une manière générale, on peut dire que
- Avec les méthodes conventionnelles de génie génétique, l’endroit où le génome est modifié est généralement aléatoire. Avec CRISPR/Cas9, la modification est effectuée sur une séquence prédéfinie du génome.
- La technique CRISPR/Cas permet non seulement d’ajouter de nouveaux gènes au génome, mais aussi de désactiver, modifier ou éliminer de manière ciblée des gènes existants.
- CRISPR/Cas9 permet de modifier simultanément plusieurs endroits spécifiques du génome (multiplexage).
- Pour les organismes (animaux, insectes, humains, champignons) dont le génome ne peut guère être modifié par les méthodes conventionnelles de génie génétique, CRISPR/Cas9 simplifiera à l’avenir les interventions sur le génome.
Risques et précision de CRISPR/Cas9
On souligne régulièrement que le système CRISPR est plus précis que d’autres techniques. Néanmoins, CRISPR/Cas9 peut entraîner des effets indésirables (hors cible). Ceux-ci se produisent lorsque la protéine Cas9 est dirigée par l’ARN guide vers un emplacement incorrect, en dehors des régions cibles prévues du génome, et y coupe le brin d’ADN. De plus, CRISPR/Cas9 coupe également en cas de correspondance approximative entre le ARN guide et la séquence d’ADN à couper.
Il convient donc de s’assurer, par une procédure d’évaluation des risques appropriée dans le cadre de la réglementation de ces techniques, que de tels effets indésirables ne se produisent pas. En effet, même si les effets hors cible sont rares, les mutations les plus infimes peuvent avoir des conséquences graves. Par exemple, l’hémophilie A (maladie du sang) est due à une seule mutation dans un gène codant pour un facteur de coagulation.
À cela s’ajoute le fait que l’édition génomique est toujours associée à l’introduction des composants Cas9 et ARNg dans une cellule. Les cellules transformées sont ensuite cultivées in vitro. Chacun de ces deux processus peut entraîner des modifications involontaires du génome.
La précision du système CRISPR/Cas9 dépend toujours de la rigueur des personnes qui le mettent en œuvre. La conception de l’expérience peut influencer l’ampleur des modifications indésirables.
Il est donc nécessaire de mettre en place des procédures de contrôle pour s’assurer que de tels effets secondaires ne se produisent pas et de prévoir une évaluation appropriée des risques dans le cadre de la réglementation de ces techniques.
Incertitudes liées à CRISPR/Cas9
L’incertitude désigne ce que nous savons ne pas savoir, mais aussi tout ce que nous ne savons pas que nous ne savons pas. Nos connaissances sur le génome et son fonctionnement sont encore très limitées. Pour rappel, les gènes ne représentent que 2 % du génome. Le rôle exact des 98 % restants de l’ADN n’est pas connu avec précision ! Le génome n’est pas une entité statique composée uniquement d’un code qui peut être modifié sans que ce processus de modification ne déclenche d’autres réactions. Le génome est plutôt une unité dotée d’une capacité d’auto-organisation, d’autorégulation et d’auto-adaptation, en relation constante avec son environnement. Il est irresponsable de parler de précision tant que nous n’avons pas compris comment les génomes fonctionnent, s’organisent et se développent. Il existe également des lacunes dans les connaissances sur le fonctionnement exact de CRISPR/cas9 et des systèmes de réparation de l’ADN. On peut certes les utiliser, mais la science ne comprend pas encore en détail ce qui se passe exactement. C’est pourquoi il est indispensable que CRISPR/Cas9 soit classé comme technique de génie génétique et soit donc soumis à la loi sur le génie génétique.
